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超聲處理對(duì)大豆親脂蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性的影響

來源：未知發(fā)布日期：2019-09-02 14:01【大中小】

采用超聲處理可減少液滴尺寸進(jìn)而提高小麥蛋白和大豆分離蛋白的乳化性。因此，超聲可作為提高LP溶解性及結(jié)構(gòu)特性的手段。然而，超聲條件處理對(duì)LP的影響研究尚屬空白。因此，本文昆山舒美超聲儀器有限公司探究超聲處理對(duì)LP的結(jié)構(gòu)及溶解性的影響，在超聲功率（120~480W）和超聲時(shí)間（10min、20min）的處理?xiàng)l件下，更好地了解超聲對(duì)LP的物化作用，并確定出最佳的超聲條件，在保留LP必要結(jié)構(gòu)特性的基礎(chǔ)上提高其溶解度及其他功能特性，以期為L(zhǎng)P的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1.儀器與設(shè)備
分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；6L落地式凍干機(jī)，上海匯分電子科技有限公司；LGR20-W型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；Delta320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)NICOLET公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；Q1000示差掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器；UV-5100型高性能紫外可見分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器；Phomo型酶標(biāo)儀，鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2傅里葉紅外光譜分析
昆山舒美超聲儀器有限公司將超聲處理后的大豆分離蛋白溶液進(jìn)行凍干，凍干后的樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5mg，與200mg溴化鉀研磨混勻后壓片進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了減少蒸汽的干擾，用干燥的N2持續(xù)注入測(cè)量室。測(cè)定時(shí)波數(shù)范圍為4000~400cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率4cm-1，得到的紅外吸收曲線采用Peakfitting軟件和高斯曲線擬合，分析大豆親脂蛋白不同超聲功率下的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化。

1.3內(nèi)源熒光光譜分析
將20mg/mL大豆蛋白溶液用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到0.1mg/mL，取一份稀釋液3mL置于石英比色皿中掃描熒光圖譜。掃描條件為：記錄發(fā)射波長(zhǎng)200~500nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為290nm，增長(zhǎng)間隔為10nm。

1.4外源熒光
采用ANS作為熒光探針測(cè)定蛋白質(zhì)的外源熒光強(qiáng)度。分別稱取0.025g不同品種蛋白樣品溶于50mL磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH值7.0）中，在室溫條件下攪拌1.0h后離心（10000g，30min），取上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定蛋白濃度，并用磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH值7.0）依次稀釋蛋白，使其質(zhì)量濃度在0.005~0.1mg/mL之間，將所得梯度的上清液溶液與8.0mmol/LANS以100:1混合，靜置3min后測(cè)其熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)4970nm，夾縫為5nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度制圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的外源熒光強(qiáng)度。

1.5差示掃描量熱法
昆山舒美超聲儀器有限公司參照文獻(xiàn)的方法，用鋁制坩堝稱取3.0mg（干基）樣品，按料液比6mL/g加入去離子水，壓蓋密封后，置于室溫平衡后測(cè)定，差示掃描量熱法（DSC）測(cè)量使用DSC-60型差示掃描量熱計(jì)以10℃/min的掃描速率在30-140℃的范圍內(nèi)進(jìn)行。使用熱分析系統(tǒng)（TA-60WS）軟件測(cè)定變性峰的溫度。

1.6溶解性
參照文獻(xiàn)的方法稍作修改測(cè)定大豆分離蛋白溶解性，用質(zhì)量濃度約為10mg/mL的蛋白質(zhì)溶液（pH值8.0），攪拌1h使樣品溶解，靜置2min后，將上清液到入離心管中離心15min(10000g)。取上清液2μL稀釋10倍，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以牛清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白的含量占樣品中總的蛋白含量的百分比。

2結(jié)束語
超聲處理對(duì)LP的結(jié)構(gòu)及溶解性具有相當(dāng)大的影響，超聲處理后在電泳圖中分子量未發(fā)現(xiàn)明顯變化，而亞基含量有所改變，而經(jīng)紅外、熒光光譜分析后發(fā)現(xiàn)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。超聲處理后LP分子間的非共價(jià)鍵減少，分子解折疊，減少了蛋白質(zhì)分子的再聚集，提高了其變性溫度及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致功能性質(zhì)的改變。昆山舒美超聲儀器有限公司認(rèn)為在本研究中，超聲功率為360W時(shí)處理10min，及超聲功率為240W時(shí)處理20min，對(duì)LP的溶解性及疏水作用的改善效果最佳，而繼續(xù)增加超聲功率及超聲時(shí)間，則會(huì)對(duì)LP的性能產(chǎn)生負(fù)面影響，可能由于過剩的能量導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度解折疊，大量疏水殘基暴露，重新形成了不溶性聚集體。由于溶解性會(huì)影響大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，因此有必要確定出最佳的超聲功率及時(shí)間，為改善LP的理化性質(zhì)及功能性質(zhì)提供最佳的預(yù)處理?xiàng)l件。

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