慢性心力衰竭( chronic congestive heart failure，CHF) 是 大多數心血管疾病的最后歸宿和死亡原因，發病率也逐年 上升，我國已達 0． 9% ，老年人群的發病率達 1． 3%。 且老年心力衰竭患者的住院時間長，再入院率高，生活質量 差。雖然 CHF 的住院率占同期心血管病的 20% ，但死亡率 卻占 40%，提示其預后的嚴重性，情況不容忽視。加參 片處方來源于臨床經驗方。

1 儀器與材料

1． 1 儀器

超高效液相色譜系統 ACQUITY UPLC ( 美國 Waters 公 司) ，PDA 檢 測 器 ( 美 國 Waters 公 司) ，Waters Q － TOFPremier 質譜儀( 英國 Waters MS Technologies 公司) ，數據 處理軟件為 MasslynxTM4． 1 和 Metabolynx( 美國 Waters 公 司) ; Mettler Toledo XS205 分析天平( 瑞士 Mettler Toledo 公 司) ; KQ-500DE 型數控超聲波清洗儀( 昆山舒美超聲儀器有限公司) ; Milli － Q 超 純 水 系 統 ( 美 國 Millipore 公 司) ; ST16Ｒ 高速冷凍離心機( 美國 Thermo 公司) 。

1． 2 材料

試劑: 甲醇( 質譜級，德國 Merck 公司) ，乙腈( 質譜級， 德國 Merck 公司) ，乙酸乙酯( 色譜級，天津市康科德科技 有限公 司) ，甲 酸 ( 色 譜 級，德 國 Merck 公 司) ，超 純 水 ( Milli － Q 制備) ，肝素鈉( 160 μ/mg，南京奧多福尼生物科 技有限公司) 。試藥: 加參片提取物( 批號 20161103，天士 力研究院現代中藥研發中心提供) 。動物: 雄性 Wistar 大 鼠，體質量( 200 ± 20) g，購自北京維通利華實驗動物技術 有限公司。

2 方法

2． 1 色譜與質譜條件

2． 1． 1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 ( 2． 1 mm × 100 mm，1． 7 μm) 。流動相 0． 1% 甲酸水( A) － 甲醇( B) ; 梯度洗脫: 0 ～ 3 min，10% ～ 10% B; 3 ～ 11min， 10% ～ 20% B; 11 ～ 21 min，20% ～ 40% B; 21 ～ 35 min， 40% ～ 70% B; 35 ～ 37 min，70% ～ 95% 。流速 0． 3 mL· min － 1 ; PDA 全波長掃描; 柱溫 30 ℃ ; 進樣量 2 μL。

2． 1． 2 質譜條件

采用電噴霧離子化源( ESI) ，MSE 掃描 正負離子模式檢測，掃描范圍 m/z50 ～ 1500，用亮氨酸腦啡 肽作校正液，進行實時校正。毛細管電壓負離子模式 2． 3 kV，正離子模式 2． 8 kV，錐孔電壓為 40 V，霧化氣為高純度 氮氣，流速為 50 L/h，碰撞氣為氬氣，脫溶劑氣流速 800 L/ h，脫溶劑溫度為 350 ℃，離子源溫度為 120 ℃。高能量掃 描時 trap 電壓為 20 ～ 60 eV。

2． 2 灌胃液制備

按照加參片中藥材提取工藝對各藥材進行提取，其中丹參、香加皮、黃芪、三七采用稀醇提取大孔樹脂純化等技 術制備提取物，桂枝、益母草等采藥材用水提醇沉等技術得 到提取物，經現有的內控質量標準檢驗為制備加參片制劑 合格的加參片提取物，按比例混合。取加參片全方提取物 2． 758 g，缺香加皮陰性提取物 2． 64 g，香加皮提取物 0． 122 g，各 加 10 mL 二 純 水 溶 解，制 得 濃 度 分 別 為 0． 275 8， 0. 264，0． 012 2 g /mL 的供試品溶液。

2． 3 血漿樣品的制備

Wistar 大鼠適應 1 周后，將 8 只大鼠隨機分為 4 組，3 個給藥組( 加參片提取物全方組、缺香加皮陰性提取物組、 香加皮提取物組) 每組 2 只，空白組 2 只。實驗前禁食 24 h，自由飲水，給藥組分別以 4． 137、3． 95、0． 183 6 g /kg( 均基 于預實驗結果確定) 的給藥量灌胃加參片提取物全方提取 液，缺香加皮陰性提取物提取液，香加皮提取物提取液，分 別在 5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1． 5 h、2 h、3 h、5 h、7 h 眼靜脈從采集血液各 500 μL，血液置于含有肝素鈉的 EP 管中，4500 r/min 離心 10 min ，取上清液血漿。各點各取 150 μL，加 4 倍量甲醇，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃， 14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃氮氣吹干，再加入 100 μL 初 始流動相復溶( 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超聲 1 min，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液轉移至液 相內插管中待用分析。

3 結果

含藥血漿、空白血漿各進樣 4 μL，按 2． 1 項下的色譜 與質譜條件進樣分析，采用 MSE 掃描正負離子檢測，獲得 的正、負離子模式下的 BPI 圖通過色譜保留時間、質譜準分子離子峰信息( MS) 、碎 片離子信息( MS /MS) ，及在加參片提取物 化學成分研究的基礎上，共指認出 14 個入血原型成分 ( 表 1) ，5 個代謝產物。M2、M3: 負離子模式下，在 m/z 459． 09 的提取流色譜 圖中，可以檢測到兩個代謝產物的色譜峰，保留時間分別為 20． 337 min( M2) 和 25． 675 min( M3) 。其中 M2 的二級質 譜中出現 m/z 459． 091 7，m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2， m/z 175． 019 0 等一系列碎片離子，體外樣品溶液毛蕊異黃 酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖苷也出現 m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2 的碎片離子，毛蕊異黃酮的［M － H］－ 分子離子 m/z 283． 057 8 比 m/z 459． 092 2 多 176 Da，M3 的二級碎片也存在 m/z 283． 057 3，m/z 269． 040 6，m/z 175． 008 8 的碎 片離子，且 M2 的峰面積大于 M3，依據碎片離子信息推斷 M2 為毛蕊異黃酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖 醛酸，M3 為毛蕊異黃酮 － 3’－ O － b － D － 葡萄糖醛酸( m/ z 175． 019 0 是葡萄糖醛酸的特征離子峰) 。

4 討論

課題組前期進行的加參片提取物化學成分研究中， 所開發的方法在入血成分分析中仍然適用，所以本實驗所 采用的色譜與質譜方法同前期開發加參片提取物化學成分 方法一致。給藥血漿各采血點各取 20 μL 血漿 混合，加入 4 倍量甲醇，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃ 氮氣吹干，再加入 100 μL 初始流動相復溶( 0． 1% 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超聲 1 min， 渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液 轉移至液相內插管中，采用液質聯用技術分析檢測。以峰個數、分離度、峰面積的大小等因素來確定血漿處 理方法。由圖 3 可以看出，乙酸乙酯萃取處理法，出峰個數 較少，其更適用于中等極性或者弱極性的成分，而對極性較 大的成分選擇能力較弱。基于加參片提取物前期化學成分 的研究，方中極性成分占多數，故舍棄乙酸乙酯萃取法。 有機溶劑甲醇沉淀法，出峰個數較多，富集度高，分離效 果也較好，且得到的峰面積較乙腈沉淀法和甲醇乙腈沉 淀法高，最終確定用甲醇沉淀法作為血漿的前處理方法。



 

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