黃酮類化合物作為抗氧化作用顯著的一類天然產(chǎn)物，其可應(yīng)用于心腦血管疾病、腫瘤、炎癥等治療， 樹莓葉黃酮同樣具有應(yīng)用價(jià)值及研究意義。目前樹莓葉提取物的研究主要包括樹莓葉中水楊酸、鞣花酸和黃酮，其中已有研究表明，樹莓葉黃酮分離組分主要包括蘆 丁、檞皮素和山奈酚衍生物，故本研究擬采用乙醇浸提法從樹莓葉中提取蘆丁等黃酮類成分，采用紫外分光光度法對(duì)所含總黃酮進(jìn)行了測(cè)定，以及通過(guò)建立 ＨＰＬＣ 完成了 樹莓葉黃酮的初步分離，從而完成了黃酮中蘆丁含量的準(zhǔn)確測(cè)定，為樹莓葉研發(fā)蘆丁獸用中藥制劑提 供理論參考。

紅樹莓葉，采自寧夏某樹莓種 植園；蘆丁 標(biāo) 準(zhǔn) 品，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司 ；甲 醇、乙 醇、石 油 醚、乙 酸 乙 酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純?cè)噭?/span>

高效液相色譜儀，美國(guó) Ｗａｔｅｒｓ公司產(chǎn)品；８４５３型紫外分光光度儀，美國(guó) Ａｇｉｌｅｎｔ公 司 產(chǎn) 品；ＤＦＴ－２５０ 手 提 式 高 速 萬(wàn) 能 粉 碎 機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn) 品；電子分析天平（賽多利斯）；恒 溫 水 浴 鍋 （ＤＺＫＷ－Ｄ－２型），北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；ＫＱ－ ５００型超聲波清洗器，昆山市超聲清洗儀器廠產(chǎn)品。

將樹莓葉經(jīng)粉碎處理后，精 確稱重１００ｇ，加入乙醇加熱回流浸提后，取濾液經(jīng) 石油醚、乙酸乙酯依次反復(fù)萃取，分離得最終乙酸乙 酯層棕紅色液體，經(jīng)旋蒸儀蒸發(fā)至１００ｍＬ，置４ ℃ 冰箱保存。將各粗提物 取１０μＬ 溶 解 于 甲 醇，并 定 容至１０ｍＬ容量瓶，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

準(zhǔn)確稱 取 蘆 丁 標(biāo) 準(zhǔn) 品 ４．００ｍｇ，用甲醇定溶于１０ｍＬ的棕色容量瓶中，充 分搖勻，得到蘆丁質(zhì)量濃度為０．４ｍｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)品 溶液，用０．４５μｍ 微孔濾膜過(guò)濾，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

采 用 亞 硝 酸 鈉－硝 酸鋁比色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品在５１０ｎｍ 處測(cè)定吸光 度，以吸光度（ｙ）對(duì)各質(zhì)量濃度（ｘ）進(jìn)行線性回歸， 得回歸方程ｙ＝３２．６ｘ－０．００４９（Ｒ２＝０．９９９２），線 性范圍０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬ。

（ＨＰＬＣ）分離 利用反向色譜分離方法建立黃酮分離條件：ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒＢａｘＳＢ Ｃ１８色譜柱（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．５μｍ），流動(dòng)相為 １ｍｇ／ｍＬ乙酸－乙腈＝７２．５∶２７．５，等度分離，柱溫 ３０ ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：２５７ｎｍ；以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以色譜峰面積（ｙ）對(duì)各質(zhì)量濃度（ｘ）進(jìn)行線性 回歸，得 回 歸 方 程 ｙ＝４Ｅ＋０６ｘ＋２２１１９（Ｒ２ ＝ ０．９９９３），線性范圍０．００２ｇ／ｍＬ～０．４ｇ／ｍＬ。

通過(guò)選擇料液比（Ａ）、乙 醇濃度（Ｂ）、提取溫度（Ｃ）和提取時(shí)間（Ｄ）設(shè)計(jì)單因 素試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表１），考察各因素對(duì)黃酮提取率的影 響，每組試驗(yàn)重復(fù)３次，取平均值。

通過(guò)選擇料 液 比（Ａ）、乙醇濃度（Ｂ）、提取溫度（Ｃ）和提取時(shí)間設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試 驗(yàn)，考察各因素對(duì)黃酮提取率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù) ３次，取平均值。

２ 結(jié)果

測(cè)定結(jié)果 。 通 過(guò) 分 別 建 立 ＵＶ 和 ＨＰＬＣ色譜分離方法，對(duì)樹莓葉黃酮按照正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)最佳工藝所得提取物，進(jìn)行初步分 離，并對(duì)蘆丁含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定和驗(yàn)證，樹莓葉黃酮 中蘆丁實(shí)際含量為１．５１４ｍｇ／ｇ，占總黃酮粗提物含 量的１３．４％。

樹莓葉作為紅樹莓果樹的副產(chǎn)物，而 黃 酮 作 為藥用植物中普遍存在的天然活性成分，且樹莓葉的黃酮類化合物含量高于果實(shí)，蘆丁作為槲皮素 的一種糖苷衍生物，槲皮素和蘆丁已被證實(shí)具有 抗腫瘤、保護(hù)心腦血管等多種生物學(xué)活性。 本試驗(yàn)通過(guò)建立 ＨＰＬＣ色譜分離方法，對(duì)樹莓 葉黃酮按照正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)最佳工藝所得提取物，進(jìn)行初步分離，并對(duì)蘆丁含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定 和驗(yàn)證。本 試 驗(yàn) 最 佳 工 藝 所 得 樹 莓 葉 黃 酮 提 取 率 １１２７ ｍｇ／１００ ｇ，顯 著 高 于 徐 雅 琴 等報(bào) 道 的 ５３３．７１ｍｇ／１００ｇ，樹莓葉蘆丁的純化及獸用中藥制 劑工藝仍需進(jìn)一步研究和探索。