當前，海洋環境污染日趨嚴重，赤潮現象頻頻發生。由赤潮生物暴發所產生的大量生物毒素通過食 物鏈進入人體，進而威脅人類健康。軟骨藻酸( Domoic acid，DA) 是一種具有神經毒性的氨基酸類化 合物，是記憶喪失性貝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-擬菱形藻( Pseudo-nitzschia) 產生。DA 能夠引 起海洋哺乳動物及人類中毒，甚至死亡。鑒于其對人類健康存在的潛在威脅，國際食品法典委員 會( CAC) 規定貝類中 DA 的安全限量為 20．0 μg /g ，美國、加拿大、歐盟、日本和中國等國家相繼執行 此國際標準。

近年來，有害擬菱形藻及其產生的 DA 在全球海域的分布范圍逐漸擴大。本格拉上升流海域 檢測到 DA 的最高濃度達 180 ng /L ; 在法國北海海域近岸海水中 DA 濃度在 102～263 ng /L 之間。 2015 年 5～8 月在美國北部西海岸暴發的一次大規模產毒擬菱形藻藻華事件，造成大量海豚、海獅及海 鳥死亡，在該海域螃蟹等海產品中檢出高濃度 DA，已超出其安全限量范圍; 2017 年中國近海發現能 夠產生 DA 的擬菱形藻，南海海域多個批次海產品中也檢出 DA，在扇貝中的累積量高達 10．1 μg / g 。DA 對海產養殖業帶來了嚴重威脅，因此需對 DA 進行有效檢測與監測。目前，DA 的檢測方法主 要有生物分析法、高效液相色譜法、熒光檢測法、質譜法、酶聯免疫分析法和毛細管電泳 法等。其中，高效液相色譜法及高效液相色譜-質譜聯用技術具有準確性高、穩定性好的特點，是目 前測定 DA 的最佳方法。海水是海洋養殖生物的棲息地，海水中毒素的濃度水平直接影響海產品的食 用安全，而對海洋養殖環境水體中毒素的有效檢測是海產養殖安全管理的前提。由于海水中 DA 含量 較低，且 DA 是一種極性較大的親水性物質，對高鹽海水基質中的 DA 直接進行儀器檢測和快速富集比 較困難。無定型 TiO2 、分子印跡聚合物、磁性材料等常被用作吸附劑，對海水中的 DA 進行分 離富集，然而這些吸附材料還未實現產業化生產，無法進行廣泛推廣應用。采用商品化C18固相萃取柱可實現海水中 DA 的富集，但富集倍數僅 20 倍; 利用商品化的反相 C18固相萃取膜盤對海水中的 DA 進行富集時，富集倍數為 20 倍，回收率達 90．0%以上，然而通過增加海水上樣量提高富集倍數時，方法 的回收率明顯下降，說明該方法富集倍數和效率低，不適于海水中痕量 DA 的高效富集。因此，急需 開發對海水中痕量 DA 分離效果好、富集倍數高，并且能夠推廣應用的新富集方法。

固相萃取膜盤技術由于具有盤片上吸附劑分布均勻、超低溶出及動力學高效率( 高流速不會影響 回收率) 的特點，在大體積水樣處理中具有傳統 SPE 小柱無法比擬的優勢，已成為環境水體微量污染物 快速富集、凈化的高效方法。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯( SDB-ＲPS) 共聚物材質且對極性 化合物有高效吸附性的固相萃取膜盤，結合高效液相色譜-紫外檢測/質譜分析法，建立了一種針對海水 中痕量 DA 進行高效富集測定的新方法，并將其應用于東海海域海水樣品中 DA 的測定。

1220 型高效液相色譜儀、6320 型電噴霧離子阱質譜儀( 美國 Agilent 公司) ;電子天平 ( 賽多利斯) ; Milli-Q 超純水處理系統( 美國 Millipore 公司) ; KQ-400KDE 型高功率數控超 聲波儀( 昆山市超聲儀器有限公司) ; ＲE100-pro 旋轉蒸發儀( 北京大龍公司) ; 磺化苯乙烯-乙烯基苯 ( SDB-ＲPS) 固相萃取膜盤、C18固相萃取膜盤( 47 mm，美國 3M 公司) ; 5 TC-C18( 2) 色譜柱( 150 mm× 4．6 mm) 、Poroshell 120 色譜柱( 100 mm × 3． 0 mm) 、ZOＲBAX 300 SB-C18 色譜柱( 150 mm × 3． 0 mm， 3．5 μm) 均購于美國 Agilent 公司; 0．22 μm 混合纖維膜( 上海市新亞凈化器件廠) 。 甲酸( 色譜純) 、乙酸銨( 優級純) ( 瑞士 Fluka 公司) ; 甲醇、乙腈( 色譜純，美國 TEDIA 公司) ; 丙 酮、異丙醇( 色譜純，德國 Merck 公司) ; DA 標準品( 美國 Sigma 公司) ; 實驗用水為 Milli-Q 超純水 ( 18．2 MΩ cm) 。

色譜條 件: Agilent 5 TC-C18 ( 2) ( 150 mm × 4． 6 mm，5． 0 μm) 色 譜 柱，90． 0% ( V /V) 乙 腈 ( 含 2．0 mmol /L 乙酸銨+0．1%甲酸) 為流動相，等度洗脫，柱溫 35℃，流速 1．2 mL /min，二極管陣列檢測器 ( DAD) 檢測波長 242 nm，進樣量 20．0 μL。與質譜聯用分析時，由 HPLC 流出進行分流，使得進入質譜 的流動相流速為 0．3 mL /min。 質譜條件: 電噴霧正離子模式檢測，全掃描范圍為 m /z 100 ～ 500，干燥氣溫度 350℃，干燥氣流速 10．0 L /min，噴霧氣壓力 206．8 kPa。二級質譜分析選擇 DA 的母離子為［M+H］+ ( m /z 312．2) ，生成特征 碎片離子 m /z 266．2、294．2、248．2。

取 2．0 L 海水樣品，經孔徑為 0．22 μm 的濾膜過濾去除懸浮顆粒物，加入 8．0 mL 甲酸進行酸化處 理，然后進行固相萃取膜盤富集。首先對 SDB-ＲPS 固相萃取膜盤進行活化處理: 加入 10．0 mL 丙酮，使 丙酮溶液通過膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 異丙醇，使異丙醇溶液通過膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 甲醇，待甲醇溶液只剩約 1．0 mL 時，加入 10．0 mL 水，待膜片上保留約 1．0 mL 水時，固相萃取膜 盤完成活化。取酸化后的海水樣品，以 6．0 mL /min 的流速過固相萃取膜盤，加入 20．0 mL 水對膜盤進 行淋洗，抽干; 使用 20．0 mL 80．0%( V /V) 甲醇分 2 次對 DA 進行洗脫，合并洗脫液，采用旋轉蒸發儀在 50℃下將洗脫液進濃縮至干，用 1．0 mL 乙腈-水( 1∶ 19，V /V) 復溶，轉移到進樣小瓶中，待測。

由文獻可知，DA 有較強的紫外吸收，為了能獲得較高的靈敏度，在 210 ～ 400 nm 范圍內進 行掃描。由 DA 的紫外吸收光譜圖( 圖 1A) 可見，DA 的最大吸收峰在 242 nm 處，因此選擇 242 nm 作為 DA 的最佳檢測波長，這與文獻結果一致。反相 C18色譜柱常用于 DA 的 HPLC 分離分析; 考 慮到 DA 是一種極性較大的弱酸性化合物，在反相 C18色譜柱上保留較弱，本研究以水-乙腈混合液為流動相，對 3 根同一廠家不同碳載量的 C18色譜柱( 5TC-C18( 2) 、Poroshell 120、ZOＲBAX 300 SB-C18色譜柱) 進行 了比較，結果表明，Agilent 5 TC-C18( 2) 色譜柱的分離效果最理想，分離度高，并且峰形尖銳對稱，說明不 同的色譜柱對海水中的 DA 分離結果差異較大，選擇碳載量相對較低的 C18柱尤為關鍵。在最佳色譜分離 檢測條件下，對添加 DA 標準品的海水樣品進行了分析，色譜圖如圖 1B 所示，DA 色譜峰尖銳對稱，與海 水中的干擾組分達到了良好分離，可以準確積分其峰面積，進而對海水中 DA 進行定量測定。

4 結 論

建立了一種基于固相萃取膜盤富集的高效液相色譜-紫外檢測/質譜測定海水中溶解態 DA 的新方 法。與傳統的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盤法的海水樣品上樣速度快、富集倍數高、不易堵塞，適 于在調查船對海水中微量 DA 的現場快速富集。利用 SDB-ＲPS 固相萃取膜盤對 2．0 L 海水中微量 DA 進行快速富集，富集倍數高達 2000 倍，方法回收率和重復性良好，使常規高效液相色譜-紫外檢測法達 到了測定實際海洋環境水體中 DA 的靈敏度要求。本研究也為大體積遠洋環境水體或極地海水中痕量 有機物現場快速富集方法的建立提供了新思路，為解決海水樣品體積大、不易在調查船上長期冷凍保存 和運輸的難題提供了新方法。